Наиболее общая проблема, возникающая при использовании описанной ниже техники получения ДНК из новых организмов, – это измерение конечной концентрации ДНК. Надо стремиться к тому, чтобы концентрация ДНК в агарозной блоквставке была «удобна» для нанесения на форезный гель. Такая концентрация должна быть определена эмпирически. Возможное число клеток и количество ДНК предложены в прилагаемых протоколах опытов. Эти цифры можно использовать как предварительные и менять в зависимости от условий куль-

1. 50 хисходный раствор Денхардта

Этот раствор – одни из компонентов смеси для прегибрндизации и гибридизации

На 500 мл раствора:

поливинилпирролидои 5 г, фиколл 5 г, БСА, фракция V 5 г.

Простерилизуйте фильтрацией через одноразовый фильтр и храните в аликвотах по 30 мл при – 20°С.

2. Раствор для лизиса клеток Е. coli

Раствор можно использовать для приготовления сферопластов из различных бактерий

Конечные концентрации На 1 л

6 мМ трис-HCl 6 мл 1 М раствора

1 М NaCl 58,4 г

100 мМ ЭДТА 100 мл 0,5 М раствора

0,5% бридж-58 60 мл 10%-ного раствора

0,2% дезоксихолата 50 мл 4%-ного раствора

0,5% са|ркозила 5 мл 100%-ного раствора

Проавтоклавируйте

Добавьте свежими: 1 мг/мл лизоцима яичного белка 20 мкл/мл бычьей панкреатической РНКазы

3. ESP

Этот раствор используется для выделения любых больших молекул ДНК.

Он имеет еще одно название – NDS.

Конечные концентрации

0,5 М ЭДТА

Автоклавируйте

1% лаурилсаркозин

Тщательно перемешайте до полного растворения 1 мг/мл протеиназы К Инкубируйте 2 ч при 37°С Храните в аликвотах замороженным

Для работы: смешайте с равным объемом образца и инкубируйте 1–2 дня при 50°С.

4. Смесь для прегибрндизации и гибридизации Конечные концентрации На 1 л

3хSSC 100 мл 30 X раствора

0,1% SDS 5 мл 20%-иого раствора

10Х раствор Денхардта 200 мл 50х раствора

10% декстрансульфат> 200 мл 50%-го раствора

ДНК спермы лосося 5 мг/мл

Смесь храните замороженной в аликвотах по 30 мл для прегибридизационного раствора и в аликвотах по 20 мл для гибридизационного раствора.

5. 1ХМ9

На 1 л: 50 г. Na2HPO «

30 г. КН2Р04

5 г NaCl

10 г. NH4C1

Разведите до однократной концентрации и проавтоклавируйте.

После автоклавирования добавьте Конечные концентрации На 1 л

1 мМ MgS04 1 мл 1 М раствора

0,1 М СаС12 0,2 мл 0,5 М раствора

0,4% глюкоза 10 мл 40%-ного раствора

0,5% казаминокислот 25 мл 20%-ного раствора

Необязательные добавки

50 мкл/мл аминокислот 10 мл раствора 5 мг/мл

10 мкг/мл витаминов 10 мл раствора 1 мг/мл

50 мкг/мл оснований 25 мл раствора 2 мг/мл

6. Pett IV

Этот раствор предназначен для отмывки бактериальных клеток перед выделением сферопластов

Конечные концентрации На 1 л

10 мМ трис-HCl 10 мл 1 М раствора

1 М NaCI 58,44 г.

Проавтоклавируйте.

7. 0,1 М ФМСФ Раствор используется для инактивации протеиназы К. Ресуспендируйте 17,5 мг

ФМСФ в

1 мл изопропанола.

Помните, что раствор нестабилен, поэтому его надо использовать свежим и готовить перед употреблением. ФМСФ очень токсичен.

Это интересно:

Как формировалось представление о критерии истин­ности знания? Чем отличается от натурфилософии наука Нового Времени? Дайте примеры.
Становление современной естественнонаучной картины мира являет собой историческую, революционную или эволюционную смену од­них научных взглядов другими. Революционными вехами на пути развития, к примеру, в астрономии были: обоснование иде ...

Эпителиальная ткань
Эпителиальная ткань (эпителий) покрывает поверхность тела, выстилает слизистую оболочку внутренней поверхности полых органов (желудок, кишечник, мочевыводящие пути и др.), серозные оболочки (плевра, перикард, брюшина) и образует железы. В ...

Рациональная и реальная картина мира
Основываясь на научном восприятии мира, многие убеждены, что окружающий мир подвластен рациональному анализу. Для них все явления имеют логическое объяснение, а еще не решенные проблемы решит наука, и то, что сегодня кажется чудом, завтра ...