Единичные нуклеотндные замены во фрагментах геномной ДНК можно обнаружить при расщеплении неспаренных участков в РНК-ДНК-дуплексах, обрабатывая эти дуплексы РНКазой А.Рис. 1 иллюстрирует последовательные этапы процедуры.

1. Синтез равномерно меченного одноцепочечного РНК-зонда с использованием транскрипции in vitro клонированного фрагмента ДНК.

2. Гибридизация зонда с комплементарными последовательностями геномных ДНК – Если в гибриднзуемой ДНК имеется замена нуклеотида, образующие РНК–ДНК-дуплексы содержат однонуклеотндные неспаренные участки.

3. Обработка дуплекса РНКазой А, приводящая к расщеплению цепи РНК по многим, хотя и не по всем, неспаренным нуклеотидам.

4. Анализ меченых фрагментов РНК при помощи денатурирующего гель-электрофореза с последующей радиоавтографией. В этом случае эффективное расщепление по неспаренным основаниям приводит к появлению на радиоавтографах двух меченых фрагментов РНК, размеры которых указывают на положение нуклеотидной замены относительно концов фрагмента ДНК. Одиночный меченый фрагмент РНК, равный по длине фрагменту ДНК, наблюдается в том случае, если в последнем нет нуклеотидных замен или если существующие замены препятствуют расщеплению РНК–ДНК-Дуплекса РНКазой.

На рис. 2 в качестве примера представлены результаты реакций РНКазного расщепления. При такой обработке расщепляется примерно 30–40% от общего числа неспаренных участков в РНК–ДНК-дуплексе. Тестирование фрагмента ДНК в двух независимых реакциях РНКазного расщепления с двумя зондами, комплементарными каждой из его цепей, позволяет выявить в нем 60–70%: всех возможных замен нуклеотидов, так как в этом случае обнаруживаются даже комплементарные замены в обеих цепях.

Оптимальными, на наш взгляд, являются РНК-зонды и соответственно исследуемые на однонуклеотидные замены участки ДНК длиной от 100 до 1000 нуклеотидов. В этом случае и сам зонд, и продукты его расщепления легко выявляются при помощи денатурирующего гель-электрофореза в полиакриламидном геле, аналогичном используемому при секвенировании ДНК. При этом отношение сигнала к фону достаточно высоко для получения четких результатов. Совсем нетрудно наработать меченые одноцепочечные РНК-зонды гораздо большей длины, но результаты обработки таких длинных цепей РНКазой неоднозначны. Еще одна проблема, которая возникает при использовании зондов с длиной цепи более 1000 п.и., заключается в том, что под действием РНКазы наряду с расщеплением РНК–ДНК-дуплексов по неспаренным участкам может происходить расщепление цепи РНК по комплементарно спаренным участкам дуплекса. Кроме того, анализ продуктов расщепления длинных РНК-зондов требует проведения денатурирующего электрофореза в агарозном геле. При этом в ряде случаев не удается полностью разделить гибриды РШ–ДШ и результаты получаются противоречивыми, так как фрагменты РНК, полученные при расщеплении ее по неспаренным участкам, но оставшиеся связанными с ДНК, обнаруживаются в геле в зонах, соответствующих длине всего зонда. Для более эффективного выявления единичных нуклеотидных замен путем РНКазного расщепления мы использовали по несколько зондов в каждой реакции отжига / расщепления. Однако полученные таким способом результаты зачастую очень неоднозначны и с трудом поддаются интерпретации. В силу перечисленных причин при исследовании фрагментов ДНК на единичные замены мы бы рекомендовали использовать в реакциях РНКазного расщепления РНК-зонды длиной от 100 до 1000 нуклеотидов.

Показано, что рибонуклеаза может расщеплять неспаренные участки и в дуплексах РНК–РНК. По данным Перучо, единичные мутации в H-ras-гене выявляются при расщеплении неспаренных участков дуплекса РНК–РНК, образованного мРНК гена H-ras и его «антисмысловой» мРНК. Наши исследования показали, что естественные мутации в гене р-глобина и искусственные мутации в промоторном участке гена р-интерферона можно обнаружить при РНКазном расщеплении как РНК – ДНК-, так и РНК–РНК-дуплексов. На клонированной ДНК-матрице мы получали равномерно меченные одноцепочечные зонды «антисмысловой РНК», ренатурировали их с комплементарной мРНК, обрабатывали образовавшиеся дуплексы РНКазой, а затем идентифицировали продукты расщепления денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле. Поэтому приведенные ниже методики для исследования образцов ДНК с равным успехом могут использоваться и при работе с РНК.

Это интересно:

Задания развивающего характера по теме "Отряд жесткокрылые. Плавунец"
Объясните второе название отряда Жуки, исходя из особенностей их внешнего строения. Предположите, почему жуки имеют разную окраску надкрыльев. В чем отличие ротового аппарата вшей и жуков? Объясните, что значит выражение: "Развити ...

Одновременность событий
Рассмотрим восприятие одного и того же события наблюдателями, находящимися в разных ИСО. Пусть световой сигнал излучается в центре ракеты, движущейся со скоростью v. Наблюдатель 1 внутри ракеты считает, что свет достигает противоположны ...

Анализ
1. Перед нанесением образцов проведите преэлектрофорез в течение 1–2 ч. 2. Прогрейте образцы 4 мин на водяной бане при 95–100°С, чтобы разделить РНК- и ДНК-цепи. 3. Отключите источник питания и отсоедините электроды. 4. Перед внесением ...