РНКазное расщепление и ДГГЭ можно использовать для непосредственного исследования фрагментов геномной ДНК, минуя стадию клонирования. Работая с равномерно меченными зондами, обладающими высокой удельной активностью, можно любым из этих методов получить желаемый результат, имея изначально 5–10 мкг геномной ДНК человека и проводя радиоавтографию 24 ч. Чем проще организм, тем выше чувствительность методов. Хотя получаемые результаты в большинстве своем можно оценить высоко, непосредственное использование суммарной геномной ДНК ставит перед исследователем ряд проблем. Это, во-первых, нередко низкое отношение сигнала к фону, особенно при РНКазном расщеплении. Во-вторых, активность равномерно меченных фосфором зондов должна быть настолько высокой, чтобы использовать их в течение дня или двух. В-третьих, при проведении некоторых анализов, особенно в случае множественных тестов, лимитирующим фактором может стать количество геномной ДНК. Любой тест тем предпочтительнее, чем меньшее количество ДНК требует.

В 1985 г. был описан принципиально новый метод, позволяющий в миллион раз амплифицировать интересующие последовательности в препарате геномной ДНК, – полимеразная цепная реакция, ПЦР. Идея метода и ее воплощение очень просты. Сначала синтезируются два дезоксиолигонуклеотида длиной 20–30 оснований, представляющие собой концевые последовательности интересующего фрагмента ДНК. Полярность выбрана так, чтобы после отжига их направления 5'-3' были обращены друг к другу. Избыточные количества этих олигонуклеотидов смешивают с геномной ДНК, и смесь нагревают для денатурации последней. Снижение температуры приводит к реассоциации олигонуклеотидов с гомологичными участками геномной ДНК. Затем проводят наращивание цепи при участии ДНК-полимер азы и дезоксирибонуклеотидтрифосфатов. Такая последовательность реакций денатурации, реассоциации и наращивания цепи повторяется 20–30 раз. Уже после двух циклов среди продуктов реакции появляются фрагменты ДНК, точно совпадающие по длине с исходным фрагментом, ограниченным олигонуклеотидами. Эти фрагменты служат матрицей для последующих реакций и идентичны большинству конечных продуктов. Процесс является по существу цепным, так как продукты данной реакции служат матрицей для последующих реакций. Количество вновь образующейся ДНК возрастает в геометрической прогрессии, поэтому за 20 циклов при 100% – ной эффективности каждого из них можно получить 220 молекул. На практике эффективность каждого цикла амплификации составляет 20–50%, т.е. при проведении достаточного числа циклов можно добиться увеличения количества специфической последовательности кратного миллиону.

Если при амплификации геномной ДНК позвоночных в качестве праймеров для ПЦР используют олигонуклеотиды длиной 20 нуклеотидов и более, то процесс этот довольно специфичен и амплифицируется только один фрагмент ДНК – Однако иногда среди продуктов реакции наблюдается накопление фрагментов, происхождение которых трудно объяснить. А поскольку эти фрагменты могут мешать последующему анализу, то рекомендуется провести еще одну серию амплификации, с использованием другого набора олигонуклеотидных праймеров. Этот метод, именуемый «nested oligo», состоит в следующем: продукт первичной полимеразной цепной реакции используется в качестве матрицы в последующих раундах ПЦР, но уже с двумя другими олигонуклеотидами, имеющими гомологии с участками ДНК внутри первичного амплифицированного фрагмента. Такая процедура позволяет получить большое количество индивидуальной последовательности ДНК, несколько более короткой, чем исходный фрагмент, и использовать ее для последующего анализа.

Имея исходно менее 1 мкг суммарной геномной ДНК позвоночных, в ПЦР можно получить несколько микрограмм специфического фрагмента. Хорошо амплифицируются фрагменты до 2000 п. н. В одной реакции можно амплифицировать одновременно и несколько фрагментов. Амплификация специфических фрагментов с помощью ПЦР может применяться и в диагностике, и при клонировании. Левинсон и Гитшейер использовали амплифицированную в ПЦР геномную РНК и РНКазное расщепление для выявления однонуклеотидных замен в гене фактора VIII, обусловливающих Х-сцепленную гемофилию А человека. Мы объясняем, как применять ПЦР в сочетании с РНКазным расщеплением и с ДГГЭ для обнаружения однонуклеотидных замен в препаратах геномной ДНК.

Это интересно:

Морфология вирионов
Для негативного контрастирования успешно применяют следующие вещества: фосфорно-вольфрамовая кислота, фосфовольфрамат натрия, фосфовольфрамат калия, кремневольфрамат натрия и уранилацетат. Концентрирование вируса необходимо проводить самы ...

Влияние гравитации на формирование органов животного
Гидроид Antennularia antennina состоит из вертикального ствола, у основания которого имеются столоны, растущие «к центру Земли», т. е. в направлении гравитационных сил. На боковой поверхности центрального ствола образуются полипы. Если от ...

Функции биосферы
Деятельность живых организмов служит основой круговорота веществ в природе. Главная функция биосферы заключается в обеспечении круговорота химических элементов, который выражается в циркуляции веществ между атмосферой, почвой, гидросферой ...