Для получения равномерно меченных РНК-зондов необходимы те же реактивы, что и для реакций РНКазного расщепления. Здесь мы приводим условия использования РНК-полиме-раз и промоторов из бактериофагов SP6, Т7 и ТЗ. Более подробную информацию по синтезу РНК-зондов можно получить из оригинальных публикаций, посвященных системе SP6.

Чтобы предупредить нежелательные последствия активности чужеродных рибонуклеаз, следует соблюдать определенные меры предосторожности при приготовлении растворов, при работе с пробирками, автоматическими пипетками и т.д. Растворы, выдерживающие нагревание, необходимо автоклавировать и хранить в стерильном виде. Бычий сывороточный альбумин, дитиотрейтол и другие растворы, не выдерживающие автоклавирования, следует готовить на стерильной воде и хранить в стерильных пробирках или бутылях. При работе с РНК желательно также стерилизовать пластиковую посуду и регулярно чистить стержни автоматических пипеток. 1. Матричная ДНК. Фрагмент ДНК-мишени нужно клонировать в плазмидном или фаговом векторе в участке, примыкающем к высокоспецифическим последовательностям промотора бактериофага. В качестве векторных систем обычно используются фаги SP6, Т7 и ТЗ. Имеются также векторы с одним либо двумя промоторами, обращенными к полилин-керным клонирующим сайтам, например pSP70-cepии, pGEM-серии, pBluescribe-серии. В идеальном случае последовательность-мишень встраивается в полилинкер между промоторами так, чтобы обратные РНК-транскрипты можно было получать с обеих ее цепей. После клонирования последовательности-мишени в векторной плазмиде с двумя промоторами обработайте 10–20 мкг плазмидной ДНК рестриктазой, разрезающей по одному из концов мишени или внутри полилинкерной последовательности. В результате вы получите матрицу для обратной транскрипции. Если в качестве зонда предстоит использовать обе цепи матричной ДНК, обработайте такое же количество ДНК еще одной рестриктазой, разрезающей по противоположному концу последовательности-мишени. Экстрагируйте обработанную рестриктазами ДНК фенолом, осадите этанолом и перерастворите в ТЕ в концентрации 1000 мкг/мл.

2. РНК-полимеразы. Очищенные РНК-полимеразы из SP6, Т7 и ТЗ выпускаются многими фирмами. Поступающие в продажу препараты обычно имеют концентрацию 5–20 ед./мл.

3. Меченые нуклеотиды. Приобретите один из четырех нуклеозидтрифосфатов, меченный фосфором в альфа-положении с удельной активностью 400 Ки/ммоль. Мы рекомендуем меченый GTP и приводим методику получения зонда на основе именно этого нуклеотида. Можно одновременно использовать и еще один меченый NTP, изменив соответственно количество взятых в реакцию немеченых нуклеозидтрифосфатов.

4. Немеченый GTP. 2 мм раствор «холодного» GTP хранить при – 70°С.

5. Смесь 3-NTP. Для приготовления «3-NTP» используют 50 или 100 мм исходные растворы остальных трех нуклеотидов в ТЕ-буфере. Концентрация каждого NTP в смеси 10 мм. Хранить при – 70°С.

6. Для транскрипции. Для приготовления 1 мл буфера необходимо:

400 мм трис-HCl, рН 7,5 400 мкл 1 М раствора 60 мм MgCl2 60 мкл 1 М раствора

20 мм спермидина 200 мкл 100 мм раствора 340 мкл Н20

7. Исходный раствор DTT. Приготовьте 1,0 М исходный раствор DTT в воде и храните его при 20оС.

8. Исходный раствор БСА. Приготовьте водный раствор без РНКазного БСА в концентрации 1 мг/мл и храните при –20°С.

9. Плацентный ингибитор РНКазы. Плацентный ингибитор РНКазы производится различными фирмами, в том числе и фирмой Promega Biotec Inc.

10. ДНКаза I. Приобретите сверхчистую, свободную от РНКазы ДНКазу I и приготовьте водный раствор в концентрации 1 мг/мл. Храните в аликвотах при – 20°С или –70°С. В своей работе мы пользовались ДНКазой фирмы Cooper Biochemical.

11. ДСН. Приготовьте 25%-ный исходный раствор ДСН в воде. Если есть возможность, используйте реактив «сверхчистой» квалификации. Не автоклавируйте. Храните при комнатной температуре.

12. тРНК-носитель. На некоторых этапах процесса требуется тРНК-носитель, свободный от примесей РНКазы и ДНКазы. Мы рекомендуем использовать дрожжевую тРНК, тщательно очищенную следующим образом:

а) суспендируйте тРНК в ТЕ из расчета 20 мг/мл, добавьте ДСН до 0,1% и протеиназу К до конечной концентрации 100 кмг/мл;

Это интересно:

Значение ласки в природе и жизни человека
В природных экосистемах ласка является консументом II порядка. И основную свою пищу – мелких грызунов уничтожает в огромном количестве, тем самым, регулируя их численность. Охотничьего значения ласка практически не имеет. Специально на н ...

Специальные биологические методы. Получение моноклональных антител
Моноклональные антитела к нескольким белкам РСВ были получены стандартными методами. Ниже приведен типичный протокол. 1. Мышам линии Balb/c внутрибрюшинно вводят зараженные РСВ клетки. Через 10 сут. инокуляцию повторяют. 2. Селезенки им ...

Способы размножения простейших
С наличием сочетания 2-х разных уровней организаций: зиготический, гаметический ядерные циклы - наблюдается большое разнообразие способов размножения: бесполое : монотомия (митоз - продольное поперечное деление); политомия (много клеток) ...