Методы. Синтез РНК-зондов
Описывается синтез РНК-зондов путем транскрипции in vitro клонированных ДНК, несущих фаговый промотор. Заметим, что удельная активность таких РНК-зондов ниже, чем полученных стандартным способом и традиционно используемых при тестировании геномных ДНК. Такой активности достаточно для работы с одной десятой от общего количества ДНК, получаемой в ПЦР, или с очень небольшим объемом клонированной ДНК – Преимущество этих зондов состоит в том, что они сохраняют стабильность более 1 нед. Кроме того, длинные зонды с выступающими концами легче синтезировать так как при этом нуклеозидтрифосфаты не лимитируют реакцию транскрипции. Если исследуется геномная ДНК и не проводится ПЦР, то следует использовать зонды с высокой удельной активностью. Важно, чтобы концентрация меченого NTP в начале транскрипции была не менее 10 мкМ, поэтому для синтеза высокоактивного зонда требуется 40–80 мкКи меченого NTP.
1. В стерильной микроцентрифужной пробирке смешайте в следующем порядке:
9 мкл воды,
1 мкл рестрицированной матричной ДНК,
1 мкл смеси 3-NTP,
1 мкл «холодного» GTP,
1 мкл GTP,
2 мкл DTT,
2 мкл БСА,
2–5 единиц плацентного ингибитора РНКазы, 2 мкл 10Х буфера для транскрипции.
2. К смеси добавьте 3–5 единиц РНК-полимеразы фагов SP6, Т7 или ТЗ.
3. Инкубируйте 1 ч при 40°С, чтобы прошла транскрипция.
4. Добавьте 1 мкл ДНКазы I для разрушения матричной ДНК; инкубируйте 20 мин при 37? С.
5. Добавьте 10 мкг тРНК-носителя, 10 мкл воды и 20 мкл ацетата аммония и проэкстрагируйте один раз 2FC.
6. После экстракции водный слой осадите этанолом; ресуспендируйте осадок в 80 мл воды, 20 мл ацетата аммония и снова осадите этанолом.
7. Ресуспендируйте осадок РНК в 200 мкл ТЕ-буфера, содержащего 0,1% ДСН. Храните при –20°С.
Это интересно:
Гормоны и биоритмы
В течение циркадного дня (бодрствования) наша физиология в основном настроена на переработку накопленных питательных веществ, чтобы получить энергию для активной дневной жизни. Напротив, во время циркадной ночи питательные вещества накапл ...
Развитие естествознания
и антинаучные тенденции
Темпы развития.
С течением времени и особенно в конце последнего столетия наблюдается изменение функций науки, и в первую очередь - естествознания. Если раньше основная функция науки заключалась в описании, систематизации и объяснении ис ...
Органические вещества, входящие в состав клетки: углеводы, их классификация
и функции
Углеводы, или сахариды – органические вещества. У большинства углеводов число атомов водорода вдвое превышает количество атомов кислорода. Поэтому эти вещества и были названы углеводами. В животной клетке углеводы находятся в количествах, ...