Белки разделяются по их молекулярным массам. Додецилсульфат натрия (SDS), связываясь с заряженными молекулами, компенсирует различия между зарядами белков.

Приготовление проб: в 30 мкл каждой фракции с DEAE-cell колонки добавляли по 15 мкл SLB.

Приготовление SLB:

1) SLB без меркаптоэтанола: 1.4 г SDS + 6 г глицерина + буфер, pH 6.8, без SDS - 7.5 мл, доводили деионизированной водой до 20 мл.

2) SLB для проб: 1 мл SLB без МЭ (1); 45 мкл МЭ; 45 мкл бромфеноловый синий .

Приготовление маркера:

10 мкл маркера (0.1 мг/мл) + 120 мкл SLB (1)

Приготовление кумасси: 600 мг кумасси голубого; 200 мл 96% этанола; 40 мл ледяной уксусной кислоты растворить в 200 мл воды.

Концентрированный буфер для форезной камеры: 7.6 г Tris-HCl + 36 г глицина доводили дистиллированной водой до 800 мл и рН 8.3-8.8. После этого в буфер добавляли 2.5 г додецилсульфата натрия.

Рабочий буфер для форезной камеры: Разводили концентрированный буфер в 5 раз.

Буфер для разделяющего геля: Tris-HCl 1.5 M (9.1 г на 50 мл воды доводили до рН 8.8), затем добавляли 200 мг SDS на 50 мл.

Буфер для концентрирующего геля: Tris-HCl 0.5 М (3 г на 50 мл). После доведения рН до 6.8 добавляли 200 мг SDS на 50 мл.

40% - бис-акриламид (60 мл): акриламид 23.34г.; бис-акриламид 0.64г.

Приготовление гелей: сведения представлены в таблице 2.

Таблица 2. Приготовление гелей для SDS-электрофореза в ПААГ.

Вещество

Разделяющий 10 % (20 мл)

Концентрирующий 5% (5 мл)

40% бис-акриламид

5 мл

0,72 мл

Буфер для геля

5 мл

1,6 мл

Вода

9,3 мл

3,95 мл

Персульфат аммония (1%)

0,7 мл

0,6 мл

TEMED*

10 мкл

15 мкл

П р и м е ч а н и е: TEMED вносится непосредственно перед заливанием геля.

После полимеризации гелей пробы (в т.ч. метчик) кипятили на водяной бане в течение 5 минут и горячими наносили в карманчики геля. Маркер (рабочий) наносили в объеме 1/6 от объема проб.

Электрофорез проводили при силе тока 20 мА на одну пластинку. Когда пробы входили в разделяющий гель, силу тока увеличивали в 2 раза и оставляли до тех пор, пока краска не доходила до конца геля (1.5-2 часа).

Красили кумасси примерно 15 мин. Затем отмывали 7.5 % уксусной кислотой в течение ночи на шейкере. Если было необходимо, окрашивали серебрением (таблица 3).

Таблица 3. Окрашивание серебрением (Silver staining, Shevchenko at al., 1996)

Реагент

Экспозиция

50 % метанол + 10% уксусная кислота

2*20 мин

20% этанол

10 мин

Вода

10 мин

Тиосульфат натрия (0.2 г/л)

1 мин

Вода

2*20 сек

Нитрат серебра (2 г/л)

30 мин

Вода

20 сек

Проявитель: карбонат натрия (30 г/л); 37% формалин 1.4 мг/л; тиосульфат натрия 10 мг/л

Пока не проявится (около 20 мин)

1% уксусная кислота

Минимум 20 мин

Страницы: 1 2


Это интересно:

Переносимость вибрации и звука
Существует довольно распространенное мнение, что вибрация является фактором, не столь радикально действующим на биологическую судьбу объекта по сравнению, например, с термическими и радиационными, действие которых, безусловно, приводит к ...

Половое размножение. Развитие половых клеток (гаметогенез)
У более сложно организованных животных или исключительно, или, по крайней мере, преимущественно, практикуется половой способ размножения, хоть зачатки этой формы воспроизведения потомства, так сказать намек на него, встречаются и у низших ...

Методы изучения морфологии микроорганизмов
При изучении морфологии микробных клеток используют различные виды микроскопии, поскольку глаз человека устроен так, что не может отчетливо разглядеть мелкие предметы. Невооруженным глазом рассматриваются предметы чаще всего с расстояния ...