Белки разделяются по их молекулярным массам. Додецилсульфат натрия (SDS), связываясь с заряженными молекулами, компенсирует различия между зарядами белков.

Приготовление проб: в 30 мкл каждой фракции с DEAE-cell колонки добавляли по 15 мкл SLB.

Приготовление SLB:

1) SLB без меркаптоэтанола: 1.4 г SDS + 6 г глицерина + буфер, pH 6.8, без SDS - 7.5 мл, доводили деионизированной водой до 20 мл.

2) SLB для проб: 1 мл SLB без МЭ (1); 45 мкл МЭ; 45 мкл бромфеноловый синий .

Приготовление маркера:

10 мкл маркера (0.1 мг/мл) + 120 мкл SLB (1)

Приготовление кумасси: 600 мг кумасси голубого; 200 мл 96% этанола; 40 мл ледяной уксусной кислоты растворить в 200 мл воды.

Концентрированный буфер для форезной камеры: 7.6 г Tris-HCl + 36 г глицина доводили дистиллированной водой до 800 мл и рН 8.3-8.8. После этого в буфер добавляли 2.5 г додецилсульфата натрия.

Рабочий буфер для форезной камеры: Разводили концентрированный буфер в 5 раз.

Буфер для разделяющего геля: Tris-HCl 1.5 M (9.1 г на 50 мл воды доводили до рН 8.8), затем добавляли 200 мг SDS на 50 мл.

Буфер для концентрирующего геля: Tris-HCl 0.5 М (3 г на 50 мл). После доведения рН до 6.8 добавляли 200 мг SDS на 50 мл.

40% - бис-акриламид (60 мл): акриламид 23.34г.; бис-акриламид 0.64г.

Приготовление гелей: сведения представлены в таблице 2.

Таблица 2. Приготовление гелей для SDS-электрофореза в ПААГ.

П р и м е ч а н и е: TEMED вносится непосредственно перед заливанием геля.

После полимеризации гелей пробы (в т.ч. метчик) кипятили на водяной бане в течение 5 минут и горячими наносили в карманчики геля. Маркер (рабочий) наносили в объеме 1/6 от объема проб.

Электрофорез проводили при силе тока 20 мА на одну пластинку. Когда пробы входили в разделяющий гель, силу тока увеличивали в 2 раза и оставляли до тех пор, пока краска не доходила до конца геля (1.5-2 часа).

Красили кумасси примерно 15 мин. Затем отмывали 7.5 % уксусной кислотой в течение ночи на шейкере. Если было необходимо, окрашивали серебрением (таблица 3).

Таблица 3. Окрашивание серебрением (Silver staining, Shevchenko at al., 1996)

Это интересно:

Создание методологии долгосрочного прогнозирования колебаний показателей жизнедеятельности по сумме текущих фаз резонансных ритмов солнечной активности
«Околоодиннадцатилетние» ритмы солнечной активности важны для прогнозирования, например, эпидемий и социальных катаклизмов. Такой прогноз (времени и частоты колебаний циклов СА) выполнен на период до 2100 года ХХI век, по нашим данным, бу ...

Что такое орбита планеты? Могут ли планеты столк­нуться при своем движении вокруг Солнца? В чем суть законов Кеплера? На каком среднем расстоянии от Солнца находится планета Меркурий, если ее период
Орбиты планет – пути в пространстве, по которым планеты обращаются вокруг Солнца; их формы близки к круговым а плоскости близки к плоскости эклиптики за исключением мало массивных тел (Меркурий, Плутон, астероиды). Так как каждая планета ...

Влияние приема пищи
Прием пищи необходим для функционирования исполнительных органов в разнообразных регулирующих системах. Регуляция обмена воды и энергии также критична для температурной регуляции. С увеличением температуры окружающей среды прием пищи сниж ...